微生物的檢測方法其實(shí)有很多種，可能我們熟悉的有計(jì)量法，計(jì)數(shù)法，當(dāng)然還有其他協(xié)議方法我們就不太清楚了，今天上海恩計(jì)為大家總結(jié)了全部的微生物檢測方法

　　微生物的檢測，無論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義，本文對(duì)生長量測定法、微生物計(jì)數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測簡要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標(biāo)的二十余種常用的檢測方法，簡要介紹了這些方法的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。

　　1. 微生物計(jì)量法

　　1.1 體積測量法

　　又稱測菌絲濃度法，通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養(yǎng)液(如10 mL)放在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間(如5 min)和轉(zhuǎn)速(如5000 rpm)，離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為(10-v)/10。菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個(gè)重要監(jiān)測指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有一定偏差。

　　1.2 稱干重法

　　可用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將一定體積待測培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1~5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40 ℃下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

　　1.3 比濁法

　　微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計(jì)測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。如使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計(jì)，在波長600 nm處用比色管定時(shí)測定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.coli的生長及誘導(dǎo)時(shí)間。

　　1.4 菌絲長度測量法

　　對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長的長度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長長度，借此衡量絲狀微生物的生長。

　　2. 微生物計(jì)數(shù)法

　　2.1 血球計(jì)數(shù)板法

　　血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1 mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。

　　2.2 染色計(jì)數(shù)法

　　為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧?，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。

　　2.3 比例計(jì)數(shù)法

　　將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細(xì)胞)濃度的液體與一待測細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.4 液體稀釋法

　　對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù)，從最適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN(Most Probable Number)得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

　　2.5 平板菌落計(jì)數(shù)法

　　這是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法。將待測菌液進(jìn)行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9 cm的平板上出現(xiàn)50~500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。

　　2.6 試劑紙

　　在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，無色)待蘸取測試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。

　　2.7 膜過濾法

　　用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。

　　3. 間接測定法

　　微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長測定的相對(duì)值。因此可利用生理指標(biāo)等間接參數(shù)來測定生物量。

　　3.1 測定含氮量

　　大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)猓占诤粑?jì)中，用KOH吸去CO2后即可測出N2的量。

　　3.2 測定含碳量

　　將少量(干重0.2~2.0 mg)生物材料混入1 mL水或無機(jī)緩沖液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　還原糖測定法

　　還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。

　　3.4 氨基氮的測定

　　離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02 mol/L的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02 mol/L的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

　　3.5 其他生理物質(zhì)的測定

　　P，DNA，RNA，ATP，NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2(用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì))，耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長量的測定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監(jiān)測溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細(xì)菌的長勢。

　　4. 商業(yè)化快速微生物檢測法

　　微生物的檢測，其發(fā)展方向是快速，準(zhǔn)確，簡便，自動(dòng)化，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測原理，結(jié)合不同的檢測方法，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如：

　　4.1 試劑盒，培養(yǎng)基等手段

　　抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如：抗干擾微生物培養(yǎng)基，新型生化鑒定管，微生物計(jì)數(shù)卡，環(huán)境質(zhì)量檢測試劑盒等，可方便的用于多項(xiàng)檢測。

　　4.2 借助新型先進(jìn)儀器

　　BACTOMETER全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測系統(tǒng)可以數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測結(jié)果，樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù)，對(duì)酵母和霉菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法(Impedance Technology)將待測樣本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi)，底部有一對(duì)不銹鋼電極，測定因微生物生長而產(chǎn)生阻抗改變。如微生物生長時(shí)可將培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測微生物的存在及數(shù)量。測定項(xiàng)目包括總生菌數(shù)，酵母菌，大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。

　　微生物OD值是反映菌體生長狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，OD是Optical Density(光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物測定的范圍，需要紫外分光光度計(jì)測最大吸收波長。用得最多的是：505 nm測菌絲菌體、560 nm測酵母、600 nm測細(xì)菌。用測OD方法畫微生物生長曲線時(shí)，同一株菌的起始培養(yǎng)濃度可以準(zhǔn)備多管(根據(jù)檢測點(diǎn)的需要，如需檢測10個(gè)點(diǎn)，就準(zhǔn)備10管)，然后每個(gè)點(diǎn)取一管出來測OD值就行了。

　　一般測菌體密度的OD的波長范圍是580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌用600 nm，已經(jīng)屬于可見光區(qū)(200 nm～400 nm為紫外光區(qū)，400 nm～800 nm為可見光區(qū))?？瞻兹缬盟?，需要離心洗滌菌體;空白如用不接種的培養(yǎng)基做就不需要洗滌，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)以求條件一致，最后注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在這個(gè)區(qū)內(nèi)的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀釋后再測，因?yàn)镺D太大，分光光度計(jì)的靈敏度就會(huì)顯著降低。

　　一般都測吸光值，而且最好是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，保持發(fā)酵液或菌體的稀釋倍數(shù)一致，吸光值與稀釋倍數(shù)不一定成正比，可保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)有可比性。且取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)最好。

　　另，用分光光度計(jì)測微生物的OD值為什么要把波長設(shè)為600 nm

　　這個(gè)波長其實(shí)只是針對(duì)濁度，而分光光度計(jì)在600 nm處對(duì)濁度的反應(yīng)比較靈敏。測吸收峰的實(shí)際意義并不大，比如LB搖瓶培養(yǎng)過夜的大腸桿菌，其實(shí)在400多納米處的吸收最大，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰。

　　以上就是我們?yōu)榇蠹铱偨Y(jié)的所以的微生物檢測方法，非常詳細(xì)，希望對(duì)大家有用。